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23	"１．挑取琼脂培养板上..." １．挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含AmP 50μg/ml），３７℃强烈摇荡过度。２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清，用１ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰上放置5分钟。４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒５次以混匀内容物，冰上放置5分钟。５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。６．12000g 4 ℃离心５分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管中。
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29	一．实验目的及背景核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
30	限制酶的类型根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。 Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。 Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。
31	Ⅱ型酶 Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。
32	酶切反应中应注意以下几个问题：１．内切酶：不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；内切酶的用量根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－３u酶短时间为宜。同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力；内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。
33	２．ＤＮＡ：作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制可通过：增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间加以克服。
34	３．反应缓冲液：反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2⁺组成，其中Mg2⁺为内切酶辅基； Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl）高盐（100mM NaCl）不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
35	４．酶解温度与时间：大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应，反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则是酶：ＤＮＡ=２－３：１２小时即可，充分酶解。
36	二、实验试剂限制性内切酶ＤＮＡ（λＤＮＡ和质粒ＤＮＡ）１０×buffer:50mM Tris HCl pH7.5 100mM NaCl 10mM MgCl2 无菌水
37	三．实验方法１．按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。 DNA １μg 10×buffer 2.5μl 无菌水内切酶 2μ 总体积： 25μl
38	"２．将反应体系充分..." ２．将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。３．Eppendorf管封上封口膜于３７℃水管中反应２小时。４．反应结束后加入EDTA至终浓度10mM终止反应。５．取１０μl反应液加２μl Loading buffer混匀于１％琼脂糖凝胶上４０伏电泳２－３小时。６．紫外透射仪上检查实验结果。
39	四．结果与分析１．记录紫外透射仪上观察到的结果。２．分析实验结果的成因。问题与讨论：１．在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？２．如何选择ＤＮＡ和限制性内切酶的用量？反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的１０％？
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53	实验四ＤＮＡ片段从琼脂糖凝胶中的分离 DNA fragment recovery from the agrose gel
54	一．实验目的及背景在生物技术实验中，ＰＣＲ反应获得的目的片段，酶切后所得特定的ＤＮＡ序列，分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它ＤＮＡ分开，这就需要有一套方法将目的ＤＮＡ从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的ＤＮＡ，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等.
55	从凝胶中分离回收ＤＮＡ的方法现在常用的技术有：电洗脱法低熔点琼脂糖凝胶法ＤＥＡＥ滤膜插片法等其中电洗脱法，经济节省，操作方便，对ＤＮＡ的回收效果好。
56	低熔点琼脂糖凝胶法 65oC琼脂糖凝胶熔点低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体
57	ＤＥＡＥ滤膜插片法 High efficient DNA high quality for microinjection <5kb fragment 100ng DNA fragment 10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes 0.5 mol/L NaOH 5 minutes 低盐缓冲液50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0) 高盐缓冲液50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)
58	电洗脱法基本原理将电泳分离后含目的ＤＮＡ片段的琼脂糖切割下来，装于透析袋中，继续在高电压下电泳，这时目的ＤＮＡ会从凝胶中电泳出进入透析袋中，由于ＤＮＡ分子量大，不能透过透析袋，从而保留于透析袋中。取出透析袋中含ＤＮＡ的溶液，进一步用酚、氯仿抽提纯化。
59	二．实验试剂及仪器 NaHCO3 2% EDTA-Na2 0.01M TBE电泳液 10.8g Tris碱 0.93g EDTA 5.5g 硼酸调pH8.2 定容1000ml 琼脂糖透析袋ＴＥ酚氯仿乙醇
60	三、实验方法一、透析袋的处理：１．切取适当长度适析袋。２．在２％NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸１０分钟。３．弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净透析袋。
61	二、电洗脱１．在长波紫外灯下（３００－３６０nm ）将含目标ＤＮＡ片段的凝胶条带切下装入透析袋中。２．向透析袋内加入２ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡。３．将透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行），加入适量缓冲液将透析袋浸没（约６－７mm）。４．接通电源，１５０伏电洗，在紫外灯下观察待ＤＮＡ全部移出凝胶。５．改变电场方向继续通电１分钟。６．从透析袋中吸出缓冲液于１－５ml Eppendorf管中。
62	"７．加入１．５倍体积..." ７．加入１．５倍体积正丁醇，混匀抽提去ＥＢ。８．在台式离心机上最高速２分钟。９．吸去上层，正丁醇溶液。１０．重复７，８，９二次。１１．自下层言ＤＮＡ的溶液中加入等体积酚氯仿（２个）抽提２次。１２．上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc ２倍体积预冷无水乙醇，于２０℃过夜。
63	"１３．12000g，4℃下离心..." １３．12000g，4℃下离心１０分钟，得ＤＮＡ沉淀。１４．弃上清，加入７０％乙醇洗涤２次后弃干乙醇。１５．加入５０μl ＴＥ溶解ＤＮＡ。１６．取１０μl ＤＮＡ溶液加入2μl Loading buffer于０．８％琼脂糖上，４０伏电泳，３小时。１７．在紫外透射仪上观察结果。１８．测定ＤＮＡ溶液OD260,OD280值。
64	结果与分析１．计算ＤＮＡ回收效率，判断ＤＮＡ纯度。２．记录电泳结果问题与讨论：１．电洗脱过程后，为什么要反向电泳１分钟？２．电洗脱后的ＤＮＡ如何去除ＥＢ？
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